Oceniano, czy wykrywanie swoistego dla NBL mRNA w PB może pełnić funkcję markera prognostycznego oraz stanowić małoinwazyjną alternatywę dla analizy szpiku kostnego (bone marrow – BM) wspierającą wczesną stratyfikację ryzyka. Zebrano 634 próbki PB od 312 pacjentów w latach 2009-2017: w chwili rozpoznania, po 2 cyklach terapii oraz po zakończeniu leczenia indukcyjnego. Analizę RT-qPCR wykonano z zastosowaniem panelu markerów mRNA NBL obejmującego PHOX2B, TH, DDC, CHRNA3 oraz DBH. Wyniki porównano z odpowiadającymi im próbkami BM.
Wyniki
Mediana wieku w chwili rozpoznania wynosiła 34,2 miesiąca (zakres 0,8-224,4), natomiast mediana okresu obserwacji 91,0 miesiąca. W chwili rozpoznania przeanalizowano 268 próbek PB, po dwóch cyklach terapii 232 próbki, a po zakończeniu indukcji 134 próbki. U 50 pacjentów (16%) oceniono wyłącznie próbki pobrane podczas rozpoznania. Spośród 634 próbek PB 41 wykluczono z powodu niskiej wydajności RNA. W chwili rozpoznania panel mRNA NBL wykryto w 242 z 268 próbek PB (90%), po 2 cyklach terapii w 72 z 232 próbek (31%), a po zakończeniu indukcji w 21 z 134 próbek (16%). Poziom nacieczenia PB podczas rozpoznania był istotnie niższy u pacjentów z amplifikacją MYCN niż u pacjentów bez amplifikacji tego genu (mediana 0,03% vs. 0,13%).
W chwili rozpoznania stwierdzono wyraźną korelację między poziomem nacieczenia obliczonym na podstawie ekspresji mRNA NBL w PB i BM (rs=0,70). Po 2 cyklach terapii oraz po zakończeniu indukcji obserwowano większą heterogenność wyników (odpowiednio rs=0,37 oraz rs=0,61). Ekspresja mRNA była istotnie niższa w PB niż w BM. Porównanie wyników RT-qPCR w PB z immunocytologią GD2 w BM wykazało korelację we wszystkich punktach czasowych. W grupie wyników ujemnych w immunocytologii RT-qPCR w PB pozostawał dodatni w 80% próbek podczas rozpoznania, w 19% po 2 cyklach terapii oraz w 20% po zakończeniu indukcji, co wskazuje na ograniczoną czułość immunocytologii GD2 w wykrywaniu choroby resztkowej o małym nasileniu podczas leczenia. Wśród 20 próbek PB dodatnich przy jednocześnie ujemnej immunocytologii BM podczas rozpoznania 85% przypadków odpowiadało stadium IV, połowa wykazywała amplifikację MYCN, a we wszystkich próbkach obecne były markery mRNA.
W parach dodatnich próbek PB i BM uzyskano istotną korelację podczas rozpoznania (p<0,001). Po 2 cyklach terapii oraz po zakończeniu indukcji obserwowano słabszą zależność (p=0,004 oraz p=0,02). Na wszystkich etapach poziom nacieczenia BM był na ogół wyższy niż w odpowiadających próbkach PB. Wyższy poziom nacieczenia BM obserwowano u pacjentów z dodatnimi wynikami PB niż u pacjentów z wynikami ujemnymi. Po zakończeniu indukcji różnice te nie osiągnęły istotności statystycznej.
Podczas rozpoznania nacieczenie PB ≥1% stanowiło czynnik prognostyczny przeżycia. Skorygowany współczynnik ryzyka (hazard ratio – HR) wynosił 2,37 dla EFS oraz 2,60 dla OS. Pięcioletni OS wynosił odpowiednio 63,5% dla nacieczenia <0,1%, 51,9% dla 0,1-1% oraz 27,9% dla ≥1%. Pacjenci bez wykrywalnego nacieczenia PB podczas rozpoznania osiągali wyniki podobne do grupy z nacieczeniem <0,1% (HR=0,90 dla EFS oraz HR=0,80 dla OS). Uwzględnienie rodzaju leczenia w analizie wieloczynnikowej nie zmieniło znaczenia prognostycznego nacieczenia PB ≥1% (HR=2,40 dla EFS i HR=2,60 dla OS). Nie stwierdzono interakcji między poziomem nacieczenia PB a rodzajem terapii.
Po 2 cyklach terapii OS różnił się istotnie pomiędzy grupami nacieczenia PB (wynik ujemny, <0,1%, ≥0,1%; p=0,02). Wszyscy pacjenci z nacieczeniem PB ≥0,1% zmarli w ciągu 66 miesięcy od rozpoznania. Po zakończeniu indukcji różnice przeżycia pomiędzy grupami PB dodatnimi i ujemnymi nie były istotne statystycznie, mimo że obaj pacjenci z nacieczeniem ≥0,1% zmarli. Analiza podgrupy pacjentów powyżej 18. miesiąca życia z chorobą przerzutową wykazała podobne wyniki do całej kohorty. W grupie 92 pacjentów z kolejnymi próbkami nie wykazano związku między utrzymującą się ekspresją mRNA w PB a wynikiem klinicznym.
W tej samej kohorcie wcześniej wykazano, że poziom nacieczenia BM oznaczony metodą RT-qPCR wiązał się z OS. Podczas rozpoznania nacieczenie BM ≥10% miało znaczenie prognostyczne, natomiast po dwóch cyklach terapii wartość progową stanowiło ≥1%, a po zakończeniu indukcji każdy dodatni wynik BM wiązał się z niekorzystnym rokowaniem. Analiza PB umożliwiła identyfikację podgrupy pacjentów z nacieczeniem BM ≥10%, u których nacieczenie PB ≥1% wskazywało szczególnie wysokie ryzyko zdarzenia (HR=1,97 dla EFS oraz HR=2,43 dla OS). W analizie wieloczynnikowej zależność ta pozostała istotna dla OS (HR=2,09). Większość pacjentów z nacieczeniem PB ≥1% prezentowała jednocześnie nacieczenie BM ≥10% (86%), co odzwierciedlało wysoką masę guza. Po 2 cyklach terapii oraz po zakończeniu indukcji nacieczenie PB po uwzględnieniu dodatniości BM nie wykazywało istotnego związku z rokowaniem, podczas gdy dodatniość BM zachowywała znaczenie prognostyczne.
Spośród analizowanych markerów najwyższą ekspresję w dodatnich próbkach PB wykazywał TH, natomiast PHOX2B najczęściej pozostawał dodatni. Dodatniość TH cechowała się wartością prognostyczną dla EFS i OS podczas rozpoznania oraz po dwóch cyklach terapii. Marker CHRNA3 również przewidywał EFS i OS w analizie wieloczynnikowej na obu etapach leczenia. Po zakończeniu indukcji dodatniość PHOX2B wiązała się z niekorzystnym rokowaniem (n=11; HR=3,06 dla EFS oraz HR=2,88 dla OS). Próbki ujemne dla PHOX2B podczas rozpoznania pozostawały ujemne także w kolejnych punktach czasowych, co może wskazywać na odmienną biologię nowotworu. Marker DBH nie wykazał istotnej wartości prognostycznej. W analizie pośredniej DDC uznano za najmniej informacyjny marker, ponieważ był dodatni jedynie w 38% dodatnich próbek oraz jako jedyny marker występował tylko w jednej próbce. W związku z tym DDC wyłączono z dalszych analiz.
Analiza kombinacji PHOX2B i TH wykazała, że podczas rozpoznania próbki dodatnie dla obu markerów wiązały się z gorszymi wynikami przeżycia: pięcioletni EFS wynosił 31,0%, a OS 40,6%. Po 2 cyklach terapii jednoczesna dodatniość PHOX2B i TH wiązała się z gorszym przeżyciem (HR=3,15 dla EFS oraz HR=2,30 dla OS). Po zakończeniu indukcji dodatniość TH i/lub PHOX2B również wskazywała na niekorzystne rokowanie (HR=2,94 dla EFS oraz HR=2,92 dla OS).
Wnioski
Nacieczenie PB podczas rozpoznania wiąże się zarówno z EFS, jak i OS, a także ma znaczenie prognostyczne u pacjentów z nacieczeniem BM ≥10%. Wykrywanie mRNA NBL w PB może dostarczać dodatkowych informacji prognostycznych w sytuacjach, gdy analiza BM nie jest możliwa. Badanie potwierdza przydatność oznaczania mRNA w PB jako mniej inwazyjnej metody wspierającej wczesną ocenę rokowania oraz dobór terapii dostosowanej do ryzyka u pacjentów z NBL wysokiego ryzyka. Chociaż analiza PB nie zastępuje badania BM podczas leczenia, jej małoinwazyjny charakter czyni ją wartościowym narzędziem monitorowania minimalnej choroby resztkowej (minimal residual disease – MRD). Wyniki wskazują zasadność wdrożenia standaryzowanych testów RT-qPCR opartych na mRNA równolegle z obecnie stosowanymi metodami monitorowania MRD i planowania terapii zależnej od ryzyka u pacjentów z NBL wysokiego ryzyka.